禽流感(Avian influenze，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属中的禽流感病毒引起的发生于各种家禽和野禽的病毒性传染病。该病于1878年在意大利鸡群中首次暴发，现已遍布世界许多国家。世界各地的高致病性禽流感主要由H5和H7亚型禽流感病毒引起，其不仅给养禽业带来了毁灭性打击，还严重影响了人类健康。高致病性禽流感因其传播快、危害大，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病[1]。 

禽流感的诊断包括临床诊断和实验室诊断。由于流感病毒的亚型众多，毒力差别很大，所以临床症状也千差万别，难以与其他有类似症状的传染病区分。而且流感的临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性症状和剖检变化，这给流感的诊断和防控带来极大的困难。因此，单靠临床诊断常常难以确诊。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径，尤其是随着分子生物学技术的飞速发展，禽流感病毒分子生物学检测方法不断取得新的进展。 

1　禽流感病毒分子生物学检测方法 

1.1　反转录-聚合酶链式反应 

反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR)是一种体外DNA扩增技术，可以从基因水平检测禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)RNA，具有高度的敏感性和特异性，并且可大大缩短对AIV的检出时间，不仅克服了病毒分离鉴定试验周期长的缺点，而且克服了因野外取材混有其他病毒造成的误诊，为禽流感早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的检测方法。另外，还可通过比较AIV血凝素基因保守序列，设计特异性引物，为可引起高致病力禽流感大暴发的H5或H7亚型AIV、临床病料或鸡胚接种物中的H5和H7亚型AIV，建立了特异、快速的检测方法。此外，H5和H7亚型AIV分型诊断技术在特异地检出H5或H7亚型AIV感染的同时，还可应用特定引物经RT-PCR扩增出H5和H7亚型AIV的包括裂解位点在内的HA基因片段，再经测序推导出的氨基酸序列来判断H5或H7亚型AIV致病性的高低，不仅为我国禽流感尤其是高致病力禽流感的防控提供先进、有效的早期快速诊断技术和监测手段，而且为高致病力禽流感的防控争取到极为宝贵的快速反应时间。Wei H L等[2]设计了一组能够对H5N1 AIV进行检测、定型的引物，建立了检测AIV H5N1的一步法复合RT-PCR，提取样品RNA后，进行了RT-PCR扩增，试验结果表明，其建立的方法快速、灵敏，在临床上可能是快速检测H5N1 AIV的一种好方法；Xie Z等[3]建立并优化了检测A型AIV且同时能区分H5，H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR。对H5，H7和H9亚型分型检测时PCR扩增DNA产物检测限可达100 pg，对AIV进行A型定型检测时PCR扩增DNA产物检测限可达10 pg，且在对H5，H7和H9分型检测时，不与其他亚型存在交叉反应，在对AIV进行A型定型检测时，也不与其他病毒或细菌性病原体存在交叉反应；在H5和H7亚型AIV  HA基因的RT-PCR扩增及克隆的基础上，建立H7亚型AIV RT-PCR诊断方法，并应用该法对鸡胚培养的AIV尿囊液、SPF鸡感染AIV的粪便进行检测，与琼脂扩散试验和电镜技术做对比，结果表明AIV尿囊液RT-PCR检测全部阳性，SPF鸡感染AIV的87份粪便RT-PCR检测69份呈阳性，样品经浓缩处理后，琼脂扩散11份呈阳性。利用电镜检测23份样品，仅检出2份。非特异性对照样品经RT-PCR检测全部阴性[4-5]。刘燕等[6]建立了鉴别H5和H9亚型AIV 的多重RT-PCR方法，谢芝勋等[7]建立了鉴别H5和H7亚型AIV的多重RT-PCR方法。这些常规RT-PCR试验需要注意的是控制好环境污染问题，核酸的提取和凝胶电泳要在不同的环境中操作，要及时清理PCR产物和电泳后的废胶，以避免其污染试验环境，造成假阳性结果。 

1.2　实时RT-PCR 

实时RT-PCR(real time RT-PCR，RRT-PCR)又称TaqMan PCR。RRT-PCR检测AIV快速、敏感、特异，由于其不仅采用了特异性引物，而且采用了特异性探针，使该方法的特异性高于传统PCR，大大减少了非特异性扩增造成的假阳性结果。全封闭反应的荧光RT-PCR技术是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现了对PCR扩增过程实时监测，无需电泳检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。应用一步法RT-PCR和荧光水解探针，用于检测A型AIV，其敏感度很高，可达10 fg(约100个)的靶RNA分子。如检测其H5和H7亚型AIV，可达100 fg(约1 000个～10 000个)的靶RNA分子。将1 550份器官或泄殖腔拭子的检测结果与病毒分离法比较，型鉴定结果相符率为89%，H5和H7亚型AIV的鉴定结果与病毒分离基本一致[8]；对RRT-PCR进行改良，结合应用MGB探针检测AIV标准毒株，通过对从多种动物宿主体内分离的A型AIV的H1亚型～H13亚型毒株的检测来评价其特异性，通过对体外转录的RNA连续稀释来分析其灵敏性，并通过用啮齿动物的RNA设置内部阳性对照来控制假阴性，结果表明其改良的RRT-PCR能够检测试验中所有已知的A型AIV，其灵敏性较常规RT-PCR高出10倍～100倍，该方法可以用于禽流感的诊断和检测野外所采样品中的病毒含量[9]。 

1.3　RT-PCR-酶联免疫吸附法 

RT-PCR-酶联免疫吸附法(RT-PCR-enzyme linked immunosorbent assay，RT-PCR-ELISA)是RT-PCR技术与酶联免疫吸附试验相结合，检测病毒的一项诊断技术。一方面RT-PCR反应体系中所用的引物5′端标记有生物素，经过RT-PCR后产生带有生物素的PCR产物，另一方面利用ELISA快速、特异、灵敏的特点，将合成的寡核苷酸探针包被在聚乙烯酶标板上，在反应孔中加入变性的PCR产物及杂交液，探针与带有生物素的PCR产物结合，再利用生物素和亲核素结合的特性，在反应体系中加入亲和素标记的过氧化氢酶或碱性磷酸酶，加入相应的底物显色，通过测光密度值和肉眼观察颜色，即可判定样品中是否含有病毒。利用该方法对禽流感毒株H5N2和H7N1进行检测，结果表明该法阳性检出率较鸡胚病毒分离高39%[10]。建立两种检测禽流感病毒株H9N2的RT-PCR-ELISA，其灵敏性都比常规PCR高出10倍，建立的RT-PCR-ELISA是检测H9N2 AIV的一种简单、灵敏的方法[11]。亢文华等[12]建立了检测高致病性禽流感病毒的RT-PCR-ELISA，试验证明其灵敏度超过病毒分离法和荧光PCR法。 

1.4　依赖核酸序列的扩增技术 

依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一项以RNA为模板的快速等温核酸扩增技术，主要用于RNA的扩增、检测及测序。该技术使用3种酶(反转录酶、核糖核酸酶H和噬菌体T7核糖核酸聚合酶)和两条特别设计的寡核苷酸引物，上游引物5′末端含有噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子序列，下游引物5′端含有与钌标记的电化学检测探针(ECL Probe)。在扩增步骤中，两个5′端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性地结合检测步骤中的ECL探针。扩增底物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获，电极上的电压引起电化学发光(ECL)反应，已杂交上的钌标记的磁珠发出的光与扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。NASBA是一种连续扩增技术，并不像PCR需要实时退火，所以在同一时间内，NASBA拥有比PCR更高的扩增效率。此外，有很多因素会影响PCR反应，如一些PCR抑制物质(尤其在取样过程中带进的物质)，NASBA技术却不会受这些因素的影响，而且即使在有DNA污染或存在的情况下，同样具有较高的特异性和灵敏度。已成功开发出可检测禽流感群特异性(H1-H15) (NASBA-AIV)，H5亚型(NASBA-H5)，H7亚型(NASBA-H7)的NASBA /ECL检测试剂盒[13]。试验结果显示，NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒至少敏感1 000倍，比常规PCR方法也敏感许多，与现行的病毒培养检测方法的灵敏度相当，并具有检测速度快、特异性强、易于操作的特点，为确定疫情和采取防范措施争取了宝贵时间。 

1.5　异源双链体迁移率测定法 

异源双链体迁移率测定法(heteroduplex mobility Assay，HMA)是基于异源双链体在聚丙烯酰氨凝胶电泳中迁移率滞后于同源双链体(homoduplex)，从而检测核苷酸变异的一项试验技术。其原理是核苷酸错配、形成“缺口”、或在相应区段插入或缺失后导致DNA双螺旋结构扭曲，从而降低DNA穿过凝胶孔的迁移率[14]。相似的DNA分子之间序列有小的变化时，则可以引起异源双链体迁移较大的距离变化。通过热变性形成单链，并同参考株制备的变性PCR产物退火，两个不同来源的单链DNA分子即可形成异源双链体，在聚丙烯酰氨凝胶上进行电泳检测，如果两个DNA分子同源性比较高，可以获得相对一致的迁移率模式。相反，如果两个DNA分子同源性比较低，就会形成复杂的迁移率模式。应用HMA检测分别来源于人、猪和禽的A型流感毒株，通过对比具有种间特异性基质蛋白核酸片段，发现从人体分离到的毒株A/Hongkong/1073/99的基质蛋白核酸片段的基因序列与禽源毒株AA/Quail/AA/Quail/Hongkong/G1/97的基质蛋白核酸片段的基因序列同源性达98.9%，因而推测毒株A/Hongkong/1073/99极有可能是由禽源流感病毒突破种间屏障而传染给人的[15]。该试验也同时证实了HMA是一种灵敏的筛选新的或不寻常的流感毒株的方法。 

1.6　核酸探针技术 

核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具。Wood G W等报道了通过扩增HA基因来分析致病毒株与非致病毒株的差异，证实了致病毒株与非致病毒株氨基酸的差异[16]。用PCR技术制备了核蛋白基因片段(NPC)的地高辛标记cDNA探针，建立并优化了检测AIV的探针杂交法，该探针具有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨禽流感的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段[17]。对以基因芯片技术为基础的检测H5，H7，H9亚型禽流感病毒的诊断技术进行了研究，结果表明DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法[18]。 

2　结语 

禽流感严重影响养禽业的可持续发展，对人类社会和自然资源的安全构成潜在的威胁。禽流感的预防和控制是一项长期而艰巨的综合工程，任重而道远。通过不断地加强对禽流感病毒分子生物学的研究，不断地加快建立更加快速、敏感、准确的分子生物学诊断方法并应用于长期不懈的流行病学监测中，对于有效地控制禽流感，尤其是高致病性禽流感对我国养禽业和我国人民身体健康构成的巨大威胁提供科学手段。